2020
jueves, 10 de julio de 2025
domingo, 18 de octubre de 2015
Aporte: Sandra Herrera
Análisis Practica #2: Cuantificación de Azucares
ANALISIS DE RESULTADOS
De acuerdo a los resultados obtenidos cuando se realizo la prueba con el espectrofotometro, podemos decir que al generarse datos de valor negativo en las absorbancias; quiere decir que existieron errores a la hora de realizar la experimentacion;ya que, revisando la grafica los puntos no siguen una tendencia de aumento o disminuacion a nivel general; causando errores al momento de realizar los calculos y analisis de los resultados. Esta tendencia negativa pudo haber sido generada por diversos factores como:
1. El equipo donde se verifico la informacion de Absorbancia (Espectrofotometro), se encontraba descalibrado, generando los errores en las lecturas hechas de la fructosa.
2. Una de las recomendaciones al trabajar en dicho equipo es usar celdas desechables o que estas esten limpias en el momento de realizar la practica, probablemente no se encontraban en dicha condicion o se contaminaron con otro tipo de reactivo o muestra bajo otra concentracion lo que tambien pudo causar error en las lecturas.
3. La muestra que se dejo preparada desde el dia sabado (3 de octubre), no guardo las condiciones de almacenamiento adecuadas para que al realizar la lectura nos diera un resultado favorable para la verificacion de la tendencia de aumento o disminucion de la accion de la amilasa. O fue quizas descartada por encontrarse una doble muestra preparada para la practica anterior (1), donde por error se descarto.
4. Al realizar las respectivas dilusiones o preparaciones para las muestras a anlizar, no se guardaron las condiciones asepticas requeridas para dicho laboratorio.
5. Cuando se realizo el calentamiento de las muestras quizas no se controlo el tiempo ni la temperatura de estas o en el momento de ponerlo a enfriar en el hielo.
6. No se adiciono la cantidad de agua requerida en el momento de hacer la dilusion de de la muestra + agua.
En caso tal de haber tenido los resultados positivos en la toma de la absorvancia, se habria podido evidenciar un aumento en la grafica y por la accion del DNS ya que el fundamento nos dice que es una reaccion redox entre el DNS y los azucares reductores de la muestra (En nuestro caso fructosa).
Bibliografia
Guzman, P; Garcia, G; Larios, E. (2013). Determinacion de azucares reductores metodo DNS. [En linea]. Universidad de America Campus de los cerros. Tomado de: http://www.academia.edu/4403544/DETERMINACION_DE_AZUCARES_REDUCTORES_METODO_DNS
Myriam Restrepo este es mi
aporte. Gracias.
LABORATORIO 3
PRODUCCION DE AMILASA POR MICROBIOS DEL SUELO
MATERIALES UTILIZADOS
1 g de tierra seca, diferentes tipos de suelo
9 ml de agua peptona da o solución salina
Cajas Petri 15 mm con nutriente de agar (0,2 de almidón
soluble)
Tubos de Ensayo
Erlenmeyers
Pipetas de vidrio
Solución de Yodo
PROCEDIMIENTO
1,086 G tierra + 9 ml de agua peptona 〖10〗^(-1) 〖10〗^(-2)
〖10〗^(-3)
〖10〗^(-4) 〖10〗^(-5) 〖10〗^(-6) 37 ºC por 24 hr+ 2,5 ml de lugol
A nuestro grupo le correspondió 〖10〗^(-5)
Se incubó a 30ºC 24 horas +solución de yodo para detectar la
presencia almidón
Número de colonias obtenidas. No se obtuvo ninguna colonia,
no coloración azul violeta para identificación de almidón ni roja para
identificación de glicógeno y dextrinas. La 〖10〗^(-4), fue la anterior si tuvo resultados.
POSIBLES CAUSAS POR LAS QUE NO SE OBTUVO RESULTADOS:
Es posible que las bacterias presentes en la muestra no
pudieran crecer debido a fallas en las condiciones de: pH, temperatura, medio
de cultivo, tiempo. En este caso pudo ser por error en el tiempo de incubación.
Por lo que el recuento fue nulo.
O Por un posible error en el procedimiento. Cada colonia se
forma a partir de por lo menos un microorganismo. Y en nuestro experimento no
se formó nada.
por el tipo de microorganismo, a temperatura óptima, tienen
tiempos de generación muy cortos otros crecen más lentamente con tiempos de
generación que necesitan de varias horas.
CONCLUSIONES
El suelo es la fuente más importante de microorganismos. Con
capacidad aminolítica, lipolítica, antimicrobiana y capacidad de síntesis de
melanina.
Los antibióticos son también un producto de las enzimas.
Cada organismo produce variedad de enzimas, las que están
participan en procesos celulares. Algunos microorganismos las producen en
cantidades más grandes y las excretan al medio.
Cada actividad enzimática le permite al microorganismo
competir contra otros microorganismos por nutrientes, por la capacidad de
degradación de compuestos.
CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES
E.Coli 10%
90%
Fructosa saca glucosa
a 37ºC
1ml
blanco (fructosa) REFRIGERAR 4ºc
0 60 90 120….300
Nuestro grupo trabajo con fructosa. Esperar 1 hr. Luego cada
½ hora.
Pasar lectura por espectofotometría calibrar 600nm con s/n
blanco
tiempo absorvancia
0 0,032
60 -0,05
90 0,091
120 0,036
150 -0,053
180 0,171
210 0,055
240 -0,045
270 -0,064
Y0= Y1+Y2+YN N= Numero de valores
N Y=Absorvancia
N=9
Y=0,173 (Suma de todas las absorvancia)
Hallamos desviación estándar:
σ = √1/N ∑_(i=0)^n▒〖(Yi-Yo〗)2
σ=√ 1/9 9 (0.032-0,2)
σ=√ 0,11111 9 (0.032-0,2)
σ=0,3333 9 (-0,168)
σ=0,3333 9 (-0,168)
σ= 2,9997(-0,168)
σ= -0,5039496
+ lugol (Diluir 1.2 ml) + 23 ml H20 Por goteo lento 5 min.
Se observò formación de colonias halo rojizo.
Nº Colonias / Diametro del halo
2/5mm = 0,4
EXTRACCION DE ADN
20 mul muestra + 480 mul H20 + Se calentó 5 min
Lectura 540 nm
CONCLUSIONES
Se observó que la temperatura incrementó tanto la producción
de fructosa, la temperatura condiciona la producción y liberación de enzima al
medio para la polimerización de dextrano.
Según los resultados encontrados en los ensayos preliminares
y en la fase final, se observó que el mejor sustrato acorde con las condiciones
nutricionales y con el cual se presentó un comportamiento.
BIBLIOGRAFIA
Universidad Nacional del Nordeste Trabajo Práctico Nº 5
FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS Estudio cuantitativo de bacterias Microbiología
Farmacia Año 2006. Recuperado de:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp5.pdf
Á. N. Ramona; R. P, Bernarda; H. M, Rómulo; C, Marluy.
“Contenido de azúcares totales, reductores y no reductores” Multiciencias, vol.
12, núm. 2, abril-junio, 2012, pp. 129-135 Universidad del Zulia. Recuperado
de:
http://www.redalyc.org/pdf/904/90424216002.pdf
Aporte Lorena Rocio Ariza V
PRACTICA
N° 3 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE AMILASA
INTRODUCCION
Las encimas son proteínas que
actúan como aceleradores de las reacciones químicas de síntesis y de
degradación de compuestos, estas se encuentran en todos los seres vivos y son
pieza esencial en su funcionamiento. Estas tienen muchas aplicaciones en
diversos tipos de industrias, entre las que se destaca la alimenticia por
ejemplo en la obtención de yogurt o en la producción de cerveza o de vino, ya
que el proceso de fermentación se debe a las enzimas presentes en los
microorganismos que intervienen en su producción. Sin embargo para mejorar los
procesos de producción pueden utilizarse enzimas aisladas, sin incluir a los
microorganismos que la producen.
Las amilasas son enzimas que
catalizan las reacciones hidrolíticas del almidón, dando origen a diversos
productos que poseen una gran relevancia para algunas operaciones y procesos
industriales, las amilasas son halladas comúnmente en plantas y animales.
Objetivos:
ü Identificar
por medio de los análisis realizados los microorganismos productores de enzimas
amilolíticas.
ü Realizar
adecuadamente los procedimientos para la identificación de los microorganismos.
sábado, 17 de octubre de 2015
Danery Eliana Avila Garzón
LABORATORIO
BIOTECNOLOGÍA
PRACTICA
Nº3
Aislamiento de microorganismos productores de amilasa
INTRODUCCIÓN
Uno
de los objetivos de la biotecnología es encontrar microorganismos productores
de enzimas, que bajo condiciones óptimas produzcan enzimas a nivel industrial.
En esta práctica se logró precisamente
encontrar estas enzimas.
A partir de muestras de suelo se pretendió
identificar las características metabólicas de microorganismos productores de enzimas amilolíticas, en
primer lugar se realizó un cultivo con esta muestra el cual se incubo a 30
grados durante 48 horas para poder realizar un recuento de todas las colonias,
de cada uno de los sitios con la dilución de yodo.
JUSTIFICACION
Un
microorganismo de uso industrial es importante ya que produce una sustancia de
interés y está disponible en un cultivo puro; además es genéticamente estable y crece en cultivos a
gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial
crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de
tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio
de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo
industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas.
Otro requisito importante es la facilidad de separar las células microbianas
del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a gran escala.
Los microorganismos industriales más favorables para esto son aquellos de mayor
tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que
estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias unicelulares e
incluso son más fáciles de filtrar.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Los
principales microorganismos usados en los procesos biocataliticos son los
hongos (levaduras y mohos) y algunas procariotas, particularmente del genero
Streptomyces, estos son capaces de ser manipulados a gran escala para producir
uno o más productos con un alto rendimiento. Los principales son:
1.- Levaduras: Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de
años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda
fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es
Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la
fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces
fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña
escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia
lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas
de digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de
oxidación de compuestos orgánicos, incluídos algunos que son tóxicos para otras
levaduras y hongos, como los derivados fenólicos
2.- Hongos filamentosos: Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan
sólo por su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Los hongos
son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la
Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la
materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en
plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende
el hombre. Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su
utilización industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la
combinación de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos
orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos
enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos
(cítrico, láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert,
Roquefort) y, evidentemente, de las setas.
3.- Bacterias: Entre las especies bacterianas de interés industrial están
las bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden
convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es productor de
antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas.
Del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede
fermentar los azúcares originando acetona y butanol. Las bacterias del ácido
láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros Streptococcus y
Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante
fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a
compuestos volátiles (geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal
importancia radica en la producción de antibióticos como anfotericina B,
kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.
ANÁLISIS DE
RESULTADOS
El
cálculo del recuento de las colonias se llevó a cabo con la siguiente formula:
De lo cual observamos que se presenta crecimiento de colonias no invasivo,
pero aun asi, se puede realizar un recuento estimativo, ya que las colonias se
distribuyen homogéneamente dentro de la placa, lo que permite observarlas en el
contador de colonias.
El
recuento de los microorganismos presentes en la muestra de suelo resultó 2
UFC/mL. Esto representa el total de los microorganismos presente en la muestra,
sin la inhibición o estimulación de alguna cepa bacteriana en específico,
debido al agar utilizado (APC). Este resultado, como se mencionó, fue obtenido
de una sola placa con las colonias con actividad amilolítica que
son las que tienen halos de hidrolisis, en las que todavía hay almidón y en las
que el almidón ya fue degradado.
CONCLUSIONES
El
estudio de la muestra de suelo realizado arrojo una cantidad 2 UFC/mL. Se lograron
así los objetivos generales, desarrollando un trabajo exitoso en la incubación
de la muestra y su posterior conteo, debiendo afrontarse problemas como la
diferencia en los duplicados, muestras difusas, poca representatividad de las
colonias contables, entre otros.
Con estos resultados la conclusión es evidente, la falta de más muestras para una comparación de cantidad de colonias contables aceptables.
Con estos resultados la conclusión es evidente, la falta de más muestras para una comparación de cantidad de colonias contables aceptables.
BIBLIOGRAFÍA
1.
Pedro F. Mateos González; MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL- on line
2.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J.
(2004). Brock, Biología de los Microorganismos. Madrid:
Pearson Educación S.A.
3.
Scheuermann S., E., & Diez J., M. C. (1999). Manual de laboratorio de Microbiología de
Alimentos.Temuco: Ediciones Universidad de La Frontera.
4.
Acuña O., Peña
W., Serrano E. (2006). La importancia de los microorganismos en la calidad y
salud de suelos. Laboratorio de Bioquímica, Centro de Investigaciones
Agronómicas, San José, Costa Rica.
Cuantificaciòn de azucares
INTRODUCCION
En esta práctica se permitió
la identificación de azucares sus diferencias por cepas de levadura observando estadísticamente la
producción del metabolito deseado proporcionándole un sustrato que garantice su
rendimiento. Esto se hará con azucares como la fructosa, la maltosa, lactosa y
la glucosa en tres horas de laboratorio calculando la absorbancia encada0,5
horas de la práctica así de esta manera gráficamente distinguiremos las
diferencias entre estos azucares.
JUSTIFICACION
La importancia del conocer el
metabolismo de los microorganismos promisorios ó de interés industrial tiene un
interés no solo biológico sino también científico.
Esto se debe
ya que el metabolismo consiste de un gran número de reacciones químicas
destinadas a transformar las moléculas nutritivas en elementos que
posteriormente serán utilizados para la síntesis de los componentes
estructurales; como pueden ser las proteínas. Otra parte importante del
metabolismo es la de transformar y conservar la energía que está contenida en
una reacción química en algún proceso que requiera de energía, como puede ser
el trabajo o el movimiento.
Nos interesa
la transformación de moléculas nutritivas, la conservación de energía y para
esto hay que estudiar y conocer el metabolismo de diferentes microorganismos.
REVISIÓN
BIBLIOGRÁFICA
Los seres vivos compartimos
los mismos tipos de átomos y moléculas básicos que nos dan diversidad de
estructuras y funcionamiento. Formados todos por combinaciones de ciertos
elementos comunes: carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre;
precisamente los mismos que conforman aminoácidos y ácidos nucleicos. Estos
fundamentos físico químicos son las que evidencian la delgada línea divisoria
entre organismos sencillos y aquellos que consideramos complejos, el punto de
partida y la columna vertebral conceptual de la biotecnología. En el nivel
molecular, todo organismo vivo funciona esencialmente de la misma manera, sea
que se trate de un ser humano, un pez, una planta o una bacteria.
Los ácidos nucleicos son
llamados muy acertadamente “moléculas de la vida”, principalmente el ADN,
aunque los bioquímicos evolucionistas están casi todos de acuerdo en que en la
biosfera primitiva de hace 3500 a 3000 millones de años, fue precedida por un
mundo donde el “protagonista” fue realmente el ARN. Tomándose en cuenta que,
según estimaciones más recientes, la Tierra se formó como tal, hace unos 4500
millones de años.
Por
su parte, las proteínas representan una clase muy importante de moléculas,
porque son un constituyente fundamental de la materia viva y desempeñan una
gama amplia de funciones en los organismos vivos. Algunas son estructurales,
como las que forman las membranas celulares; otras, son reguladoras de procesos
biológicos, como las hormonas de naturaleza proteica; algunas son catalíticas,
como las enzimas que intervienen y facilitan las reacciones bioquímicas
fundamentales; existen aquellas que actúan como transportadoras de otros
compuestos y elementos esenciales, como la hemoglobina; otras son “defensivas”
como los casos de las inmunoglobulinas. En fin, se puede afirmar que las
proteínas son los pedestales funcionales y estructurales, convirtiéndose en los
responsables de casi todas las propiedades distintivas de los seres vivos. En Colombia, el arroz es el sustrato más
utilizado para la producción de biopreparados de Trichoderma sp. A partir de procesos de
fermentación artesanal e industrial. En la actualidad la empresa Sanatrade S.A.
elabora un producto llamado Tricho-D el cual tiene como ingrediente activo al
hongo Trichoderma harzianum, conocido como un
bio-regulador y antagonista natural de los fitopatógenos, este producto es
utilizado en Colombia en investigaciones para la protección de zocas del café
frente al ataque de Cerotocystis fimbrata. (Castro y Rivillas, 2003).
La
utilización de otro tipo de sustratos naturales para la producción de esporas
de Trichoderma sp. ha sido poco estudiada en el país
sólo empresas como Natural Control ubicada en la Ceja, Antioquia y Laverlam
S.A., en Cali, producen toneladas de estos biopreparados utilizando arroz como
sustrato base para el desarrollo y esporulación del hongo, trabajos realizados
por Fernández y Vega (2001), probaron la eficiencia y viabilidad de la
producción de esporas de Trichoderma sp. con subproductos de la industria
azucarera de Cuba, con soportes sólidos como materiales celulósicos, atendiendo
a la alta capacidad celulítica de este hongo.
La
utilización de subproductos agrícolas con altos contenidos celulósicos plantea
la posibilidad de reemplazar los sustratos utilizados como el arroz y el trigo,
los cuales actualmente encuentran limitado su utilización por los altos costos.
Así mismo, existen semillas de árboles con alto contenido de nutrientes que
pueden ser utilizadas para enriquecer los sustratos, como es el caso de las
semillas del árbol del pan (Artocarpus incisa), es una especie
perteneciente al género de los Artocarpus, dentro de la tribu de las
Artocarpeae, de la familia de las Moraceae con cientos de variedades de árboles
distribuidas en zonas tropicales de Asia y Suramérica. Las semillas de los
frutos del pan producidas abundantemente por el árbol son muy nutritivas. Son
ricas en azucares contienen entre un 20 y 37% de carbohidratos, calcio, hierro,
fósforo y niacina, y en vitaminas C y B1.
METODOLOGÍA
|
Obtener caldo
estéril de 5.000.000ug/l
|
|
Del caldo estéril
obtener solución estándar de 150ug/l
|
|
Obtener
soluciones de
|
|
100ug/l
|
|
50ug/l
|
|
25ug/l
|
|
Tomar datos de
absorbancia cada 0,5 horas por 3 horas
|
|
Graficar y
registrar
|
RESULTADOS
Tabla N°1 Resultado De Absorbancia Vs Tiempo
|
Tiempo
|
0
|
0,5
|
1
|
1,5
|
2
|
2,5
|
3
|
|||||||||||||||||||||
|
100
|
50
|
25
|
100
|
50
|
25
|
100
|
50
|
25
|
100
|
50
|
25
|
100
|
50
|
25
|
100
|
50
|
25
|
100
|
50
|
25
|
||||||||
|
Fructosa
|
0,01
|
0,03
|
0,09
|
0,003
|
0,001
|
0,001
|
0
|
0,002
|
0,001
|
0,001
|
0,003
|
0,002
|
0,001
|
0,002
|
0,005
|
0,005
|
0,004
|
0,001
|
0,001
|
0
|
0
|
|||||||
|
Lactosa
|
0,003
|
0,004
|
0,002
|
0
|
0,001
|
0,004
|
0,004
|
0,003
|
0,002
|
0,005
|
0
|
0
|
0,002
|
0,007
|
0,001
|
0,003
|
0,009
|
0,001
|
0,002
|
0,009
|
0,001
|
|||||||
|
Maltosa
|
0,001
|
0
|
0,002
|
0,003
|
0,002
|
0,001
|
0,008
|
0,003
|
0,001
|
0,007
|
0,003
|
0,005
|
0,006
|
0
|
0,004
|
0,002
|
0
|
0,002
|
0
|
0
|
0,002
|
|||||||
|
Glucosa
|
0
|
0,002
|
0,03
|
0,001
|
0
|
0,001
|
0
|
0,004
|
0001
|
0,001
|
0
|
0,006
|
0,005
|
0,004
|
0,001
|
0,001
|
0,004
|
0,01
|
0,001
|
0,004
|
0,001
|
|||||||
|
AZUCAR
|
1 LEC
|
2 LEC
|
|
|
FRUCTOSA
|
0
|
8,4
|
|
|
LACTOSA
|
0,2
|
3,2
|
|
|
MALTOSA
|
0,3
|
1
|
|
|
GLUCOSA
|
0
|
0
|
Tabla N°2 Grados Brix
Graficas
Grafica N°1 Fructosa
Grafica N°2 lactosa
Grafica N°3 Maltosa
Grafica N°4 glucosa
ANÁLISIS
DE RESULTADOS
Tanto la fructosa como la glucosa tuvieron comportamientos similares en
todos los tiempos sin embargo la maltosa es el azúcar que más cumple con el
metabolismo ya que como se ve en la gráfica cumple con las fases de
crecimiento. De esto se observa que la fructosa
y glucosa tienen un metabolismo mejor en esta clase de cultivos, es decir
cumple con lo solicitado.
Con los datos obtenidos en el
espectrofotómetro, se puede deducir que la absorbancia aumenta con la
concentración de las soluciones y la distancia que recorre el rayo de luz, debido a que hay mayor cantidad de analito (
mayor cantidad de moléculas que adsorben energía para excitarse). Las cuales
toman esta energía del rayo de luz, disminuyendo la intensidad de la radiación, por lo que la transmitancia disminuye al aumentar
la concentración.
CONCLUSIONES
En el estudio realizado se evidencia que el tiempo es un
factor determinante durante la cuantificación de azucares, ya que durante las
pruebas se obtuvo una eliminación comparación con cada uno de ellos y en
diferentes tiempos cada absorbancia es diferente; es decir A mayor concentración en las soluciones, mayor será
la cantidad de soluto adsorbida cuando se mantiene la cantidad de adsorbente
constante.
BIBLIOGRAFIA
1. Chaplin MF (1986) Monosaccharides. En Chaplin MF,
Kennedy JF (eds.): “Carbohydrate
Analysis: A Practical Approach”. IRL Press (Oxford, England)
pp. 1-36. Descripción muy simple pero bastante completa de los principales
métodos de análisis de monosacáridos
2. A.O.A.C. Official Methods of Analysis. 1980. Horwitz W. (ed). Ed. 13th.
Washington, U.S.A.
3. Ting, S.V. 1956.
Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total
Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food Chem. Vol. 4(3) 263-266.
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