Cordial saludo compañeros de grupo este es mi aporte Betty Segura Moreno.
PRACTICA No. 03: Aislamiento de microorganismos
productores de amilasa
INTRODUCCIÓN
Uno de los objetivos de la biotecnología es encontrar
microorganismos productores de enzimas, que bajo condiciones óptimas produzcan
enzimas a nivel industrial. En esta práctica se
logró precisamente encontrar estas enzimas.
A partir de
muestras de suelo se pretendió identificar las características metabólicas de microorganismos productores de enzimas amilolíticas, en
primer lugar se realizó un cultivo con esta muestra el cual se incubo a 30
grados durante 48 horas para poder realizar un recuento de todas las colonias,
de cada uno de los sitios con la dilución de yodo.
Los
microorganismos adecuados para la producción de enzimas deben ser estables y
aceptados por las autoridades de control, tener facilidad y rapidez de
crecimiento con nutrientes sencillos y relativamente baratos, producir una
enzima de alto rendimiento, que sea fácil de aislar, purificar y concentrar sin
contaminantes o tóxicos. Tradicionalmente, el objetivo es maximizar la
velocidad de formación de la enzima para minimizar los costos de producción de
la enzima. En los microorganismos, el rendimiento es igual a la masa de células
obtenida, multiplicada por el volumen, por ello, lo adecuado es combinar de la
mejor manera la cepa seleccionada, las condiciones de de recuperación y
fermentación y el equipo más apropiado.
JUSTIFICACION
Un microorganismo de uso industrial es importante
ya que produce una sustancia de interés y está disponible en un cultivo puro; además
es genéticamente estable y crece en
cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo
industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto
período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente
barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un
microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales
o plantas. Otro requisito importante es la facilidad de separar las células
microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a
gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son
aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias
filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias
unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar.
Habitualmente los microbios
se sumergen en fermentadores bien agitados y aireados o en fermentadores
sólidos o semisólidos, por ejemplo, los que producen lactasa, a-amilasa,
proteasa, entre otros. Lo más adecuado es usar enzimas termostables, que a
mayor temperatura, producen mayor velocidad de reacción, menor viscosidad del
sustrato, mayor solubilidad del reactivo y menor contaminación. Además, para
liberar más rápido la enzima se añaden surfactantes al medio de cultivo que
aceleran la liberación. Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo por
numerosas enzimas con distintas funciones, por ello, una pequeña cantidad de
enzimas son necesarios, inclusive a escala industrial; los preparados
enzimáticos necesitan poco espacio de almacenamiento y las reacciones son
controladas de forma sencilla y pueden detenerse cuando se ha alcanzado el
grado deseado de conversión de sustrato.
OBJETIVO GENERAL
- Aislar y seleccionar microorganismos productores
de enzimas amilolíticas a partir de muestras de suelo.
PRACTICA No. 03: Aislamiento de microorganismos
productores de amilasa
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos /
instrumentos):
- 50 ml de agua destilada
previamente esterilizada ó agua peptonada
0.1% (p/v)
- Pipeta de 10 ml
- Pipetas de vidrio 1 ml
estéril
- 1 gr de tierra seca recogida
1 cm por debajo de la superficie, de diferentes sitios ó también a
diferentes alturas ó se pueden tomar muestras de diferentes tipos de suelo
(Se debe colocar en bolsas estériles y rotular). Mínimo utilizar tres
muestras
- Una solución de yodo
- Bastoncillos de algodón
estéril
- Cajas de petri estéril con 15 a 20 mm con nutriente de agar
preparado con 0,2 de almidón soluble
- Rotulador.
ANÁLISIS DE RESULTADOS OBTENIDOS
|
Sitio
de muestreo
|
N
° colonias totales
|
N
° colonias con halos
|
Diámetro
de halo de hidrolisis de col. representativas
|
|
|
Tierra del suelo
|
1603
|
5
|
Col
1
|
0,5 mm
|
|
Col
2
|
0,4 mm
|
|||
|
Col
3
|
0,6 mm
|
|||
El cálculo del recuento de las colonias se debe realizar aplicando
la siguiente formula:
De
lo cual logramos observar que se
presenta crecimiento invasivo, pero aun así, se puede realizar un recuento
estimativo, ya que las colonias se distribuyen homogéneamente dentro de la
placa, lo que permite observarlas en el contador de colonias aunque para este
caso se no se empleó el mismo, solo se contaron.
El recuento de los microorganismos presentes en
la muestra de suelo resultó 1603 UFC/mL. Esto representa el total de los
microorganismos presente en la muestra, sin la inhibición o estimulación de
alguna cepa bacteriana en específico, debido al agar utilizado (APC). Este
resultado, como se mencionó, fue obtenido de una sola placa con las colonias con
actividad amilolítica que son las que tienen halos de hidrolisis, en las que
todavía hay almidón y en las que el almidón ya fue degradado.
En
una muestra se presentó mayor
crecimiento de microorganismos sobre el almidón.
Se
aplicaron técnicas apropiadas para el aislamiento de microorganismos productores
de amilasas. Se presentó actividad enzimática por el crecimiento de los halos
de hidrolisis
Los
microorganismos son los encargados de la producción de encimas celulosas y por tanto de la degradación de
celulosa, componente.
Para
la degradación enzimática de la celulosa se hace necesaria la participación de un
grupo de enzimas, celulasas, que hidrolizan oligosacáridos y polisacáridos
unidos mediante enlaces ß 1-4 en monómeros de glucosa. Estas enzimas actúan de
manera complementaria ya que sería imposible la degradación total de éste
compuesto con un solo tipo de enzima, por tal razón las celulasas se clasifican
en endoglucanasas, exoglucanasas, celobiohidrolasas y glucosidasas.
En
la actualidad el estudio de los microorganismos capaces de degradar diferentes
tipos de residuos como los domésticos y agroindustriales, ha tenido gran
importancia, debido al potencial que muestran los microorganismos y al uso de
los subproductos que se pueden obtener bajo condiciones controladas, por
ejemplo etanol. Jeya et al en el 2009 (1) reportaron que Trametes hirsuta es
capaz de generar azúcares reductores a partir de la biomasa celulósica
proveniente de residuos de arroz y además aseguran que éste es un sustrato
adecuado para la producción de este tipo de enzimas bajo condiciones de pH,
temperatura y concentraciones de sustrato determinadas previamente, por lo
anterior se confirma el uso de microorganismos en la degradación de residuos
ricos en celulosa.
CONCLUSIONES
El estudio de la muestra de suelo realizado
arrojo una cantidad 1603 UFC/mL. Se lograron así los objetivos generales,
desarrollando un trabajo exitoso en la incubación de la muestra y su posterior
conteo, debiendo afrontarse problemas como la diferencia en los duplicados,
muestras difusas, poca representatividad de las colonias contables, entre
otros.
Se lograron aislar microorganismos productores
de amilasas, donde hubo una reacción del almidón con el lugol; se puede
observar almidón presente por la reacción con el lugol.
En esta práctica se logró confirmar la capacidad de hongos del genero Aspergillus
sp para la producción de amilasa.
Las enzimas microbianas se
consideran seguras porque son extractos naturales, además las enzimas tóxicas
son muy raras. La introducción de nuevas enzimas requiere una demostración de
que no son tóxicas. Los microorganismos más comunes usados en el sector
comercial son los hongos y bacterias, entre ellos se destacan los Aspergillus
niger, A. oryzae y Bacillus subtilis.
BIBLIOGRAFÍA
1.
Pedro F. Mateos González; MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL- on
line.
2.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker,
J. (2004). Brock, Biología de los
Microorganismos. Madrid: Pearson Educación S.A.
3.
Scheuermann S., E., & Diez J., M. C. (1999).
Manual de laboratorio de Microbiología de
Alimentos.Temuco: Ediciones Universidad de La Frontera.
4.
Acuña O., Peña
W., Serrano E. (2006). La importancia de los microorganismos en la calidad y
salud de suelos. Laboratorio de Bioquímica, Centro de Investigaciones
Agronómicas, San José, Costa Rica.
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